유전공학 기술

* 디데옥시 사슬 종결법[i] (for 염기서열결정)

           - ddNTP 사용 : 3’ 탄소 - OH의 O가 빠져 결합 불가함 ㆍ 서로 다른 색으로 되어 있어 색으로 염기 구분 가능.

           - 목적 유전자 + DNA pol + DNA프라이머 + dNTP + ddNTP

           - 다양한 길이의 DNA 합성ㆍ한가지 형광물질 존재(by ddNTP)

           - 짧은 쪽의 염기부터 순서 연결함 → 염기서열 결정 됨.

           - 주형가닥은 합성된 염기서열과 상보적으로 계산한다. (실수 유발 부분)

          

* 합성 중 염기서열 결정법[ii] (기계가 알아서 해줌)

           ① 비드 + 단일가닥 목적 유전자 + 프라이머 를 결합한 상태

           ② dNTP 를 순서대로 첨가( ex, A→T→G→C ) 하여 dNTP 결합시 생기는 2Pi 의 여부를 방사선 검출로 확인함.

           ③ 방사선 나오는 순서와 dNTP 첨가순서를 매칭하면 합성된 dNTP 의 순서를 알수 있다.

           ④ 주형가닥의 염기서열은 합성된 염기서열과 상보적인 서열이다.(실수 조심)

 

* DNA 클로닝(보관용)[iii] : 유전자ㆍ유전체 다량 복제하여 보관용 클로닝

           - 세균의 플라스미드로 재조합 DNA ( = 벡터 + 목적 DNA ) 를 만들어 세균이 형질 전환 하도록 함.

                     (벡터 = DNA 운반체)

           - 재조합 DNA 제조시 플라스미드와 목적 DNA를 동일한 제한효소로 절단 → 연결 → DNA 리가제로 연결

                      ► 제한효소 : 특정 DNA 염기서열(6개의 염기쌍ㆍ회문구조)을 인식하여 결합 후 DNA 절단함.

                                 ex) EcoR I , Hind III

                     ► 절단방식 : sticky 말단 , blunt 말단

 

           - 재조합 DNA 의 선별 방법[iv]

                     ► 선별용 벡터 : ampR + lac Z ( → β 갈락토시다제 : X-갈(흰색) → X (푸른색) +갈락토스 )

                                ㆍ ampR : 재조합 DNA 가 세균에 들어갔는지 확인용 è amp 처리시 콜로니 생성된 것을 선택

                                ㆍ lac Z : 목적 DNA가 벡터에 잘 삽입되었는지 확인용 ( → lac Z유전자 사이에 목적 DNA삽입함 )

                                           è Lac Z 발현시 β-갈락토시다제로 인해 X-gal(흰색)이 X(푸른색)로 돼 푸른색이 보임.

                                                     따라서, 흰색 콜로니를 선택[v]

                                                  cf ) Lac I 를 비활성 시키기 위해서 알로락토스 or IPTG 를 넣어준다. 그래야 정상적 발현.

           - 벡터

                     ► 플라스미드

                     ► BAC (세균 인공 염색체) (대용량 벡터) : 복제원점 남기고 짧게 절단 후 큰 목적 DNA와 결합시킴.

 

* DNA 클로닝 (발현용) : 유전자ㆍ유전체 다량 복제하여 발현용 클로닝

           - 진행과 원핵의 발현 체게 다름[vi]

                     ► 전사개시 차이 : 시그마 인자 vs 전사인자(@조절요소)

                                è 제한부위 앞에 원핵프로모터 존재 & 목적 진핵 유전자의 프로모터 제거 후 삽입

                     ► 스플라이싱 유무 차이

                                è 인트론 제거된 목적 유전자 (by cDNA 합성) 사용

                                ㆍcDNA 제작 by 역전사 효소 ← 일부 바이러스, 진핵에 존재

                                           : RNA 의존성 DNA pol & DNA 의존성 DNA pol

                                           : mRNA + 역전사 효소 + 인공합성 poly T 프라이머 à 인트론없는 DNA = cDNA

 

* 진핵 유전자를 → 진핵 ( 효모 ⊃ 플라스미드 ) 에 클로닝 함. (PEET시험용은 아니고, 실제로는 주로 사용)

           - 효모 : 형질전환 함.

           - YAC : 효모 인공 염색체 벡터

 

* DNA gel 전기영동 (단백질 전기영동 SDS-PAGE 와 유사)

           - 아가로스 : 섬유성 망상구조 → 이동속도 차이 유발

           - DNA 염색약 : EtBr

 

* DNA 혼성화 : 탐침 만들어서 뿌림.

           - 탐침 : ① 단일가닥 ㆍ ② 목적유전자와 상보적 서열 ㆍ ③ 방사선

           - 혼성화 정확도 향상법 (= 수소결합을 억제해준다) : ① 온도를 높여줌(비특이적 결합 방지) ㆍ ② 전혼성화(무작위 서열의 DNA 절편 혼합 ← 연어 정자 뿌려줌)

 

* Blotting = 전기영동 후 혼성화

           - 서던 : DNA ← ssDNA 탐침

           - 노던 : mRNA ← ssDNA 탐침

           - 웨스턴 : 단백질 ← 항체 탐침

 

* PCR : DNA 특정 염기서열 범위를 대량 복제ㆍ증폭

           - 원하는 범위의 ds DNA 생기는 반복 횟수 : 2n - 2n

           - 범위 설정 : 프라이머 합성

           - 과정

                     ① 변성(가열) (고온) : 단일가닥으로 됨.

                     ② 프라이머 결합 (저온)

                     ③ 중합 (변성과정을 견딜수 있는 극호열균(Taq)의 DNA pol) (중온) ← Taq의 DNA pol의 최적온도

 

* 유전자 발현을 분석

           - mRNA 또는 단백질로 확인 (DNA로 확인 불가)

 

* RT-PCR (집에 아빠 있어?) : cDNA에 PCR하여 특정 유전자에 대해 발현 여부를 확인 하는 것.

           - 목적 : 원하는 특정 유전자가 발현되는지 확인 하는 것. ex) 코로나 유전자 발현여부 확인.

           - 절차

                      ① 확인할 세포에서 모든 mRNA 를 추출하여 역전사 함. → cDNA 생김

                      ② 생성된 cDNA들과 함께 원하는 특정 유전자에 결합하는 프라이머를 넣고 PCR(증폭)함.

                      ③ 증폭 유무를 확인함. → 증폭되면 원하는 특정유전자가 발현되고 있는 것임.

 

* micro Array (집에 누구 있어?) : 특정 유전자가 아닌 현재 발현중인 모든 유전자를 확인 하는 것

           - 목적 : 후보군 中 발현되는 유전자 확인 → 후보군에 포함할 유전자 종류는 많을수록 좋다

           - 절차

                     ① 후보군(= DNA chip) 제작 (확인할 범위 설정) : 한칸에 1종류 유전자의 단일가닥을 고정함.

                                ex) 9칸 DNA chip 이라면 9종류의 유전자 단일가닥이 들어있는 것임.

                                ex) 세포의 mRNA를 사용하여 DNA chip을 만들고 동일세포의 시점을 달리한 후

                                           mRNA를 이용한 cDNA를 이용한 탐침으로 혼성화 하면 시점에 따른 mRNA를 확인 할 수 있다.

                      ② 확인할 세포에서 모든 mRNA 를 추축하여 역전사 함 → cDNA 생김

                      ③ 생성된 cDNA를 탐침(단일가닥, 방사성표지)으로 만들어 후보군(DNA chip)에 혼성화 함.

                    

* 재자리 혼성화

           - 목적 : 특정 유전자의 발현 위치 확인

           - 절차 : 세포안으로 직접 탐침을 뿌려서 확인 → 발현중인 단일가닥 mRNA와 결합 (dsDNA와는 결합하지 않음)

           ex) 눈 유전자 결합 탐침, 날개 유전자 결합 탐침, 배 유전자 결합 탐침. → 발현중인 단일가닥 mRNA와 결합

 

* 생물 복제 기술[vii]

           - 수정란 : 핵 n + n / 미분화 세포 / 세포질 ⊃ 발생에 필요한 물질

* 식물 복제 : 성체에서 미분화세포 획득 가능

* 동물 복제

           - 성체에서 미분화세포 획득 불가능

           - 발생과정 / 기관 복잡

           - 동물 줄기세포

                     ► 성체 줄기세포 : 일부 미분화 상태 (ex, 골수에 있는 조혈모세포)

                     ► 배아 줄기세포 : 완전 미분화 상태

                     ► 역분화 / 유도만능줄기세포 : 전는성 줄기세포로 전환

                                ㆍ 4개 유전자 = OK SM = Oct 3/4 + Sox 2 + Klf 4 + c-Myc

           - 핵이식 = 기분화의 체세포 (따로 핵융합을 못하므로 체세포 핵 필요)  + 핵없는 난자 → 착상

                     ► 체세포 핵 : 미분화상태로 전환할 것, 텔로미어 복구 된 것일 것.

 

* 유전공학기술 : 의학적 이용

           - 유전병의 진단 : 다형성[viii] (동종 내 유전적 차이) ⊃ SNP ⊃ RFLP (=제한부위에서의 SNP)

                     ► SNP (단일 NT 다형성) : 1 bp 차이

                     ► RFLP (제한효소 절편 길이 다형성) : SNP 중에서 제한부위 안에서 1bp 차이가 나서 절단되는 길이가 다름.

 

* 유전자 치료[ix]

           - 타인세포 : 정상골수세포 이식 ⦁⦁⦁ 거부반응

           - 자가세포 : 유전자치료 ⦁⦁⦁ 거부반응없음.

           - 정상 유전자를 레트로 바이러스 RNA와 재조합하여 감염을 시킴 → 레트로 바이러스가 핵에 DNA형태로 삽입하여 치료 è 레트로 바이러스 RNA 를 벡터로 사용하는 것임.

 

* 법의학적 이용 : DNA 동일성 판단

           - DNA finger printing (지문분석법) : DNA 에 대한효소 처리 → DNA 절편 → 전기영동

                     → 제한부위 위치가 사람마다 다 달라서 전기영동시 밴드가 사람마다 고유함.

           - STR 이용 PCR[x] : 반복횟수가 차이가 있는 경우 DNA 동일성 판단가능

                                                                (반복횟소 동일한 STR은 DNA 동일성 판단 불가능함)

                                                                è 반복횟수가 많은 STR을 PCR할 경우 전기영동에서 이동거리 짧다.

                     ► STR : 반복단위 짧음.

                     ► VNTR : 반복단위 길다.