H&E staining(Giemsa 염색)
양전하성 hematoxylin과 음전하성 eosin을 혼합한 염료로 혈구 및 동물의 조직 염색에 적합하댜 일반적으로 핵산(언 음전하성 DNA) 을 포함한 핵은 염기성 hematoxylin 에 의해 진한 청색으로 염색되지만 세포질(언 양전하성 단백질)은 산성eosin에 의해 적색으로 염색된다.
Step 1. 조직 샘플의 준비 (파라핀 박편자르기)
® 고정 (fixation)
알코올에 의해 세포막 투과도를 증가시키고 포르말린 (formalin) 용액으로 세포내 물질에 교차결합을 형성시켜 샘플을고정하고부패되는것을방지한다.
® 탈수 (dehydration)
조직 및 세포내에 지용성 파라핀 (연 paraffin) 을 매질로 재우기 위해서 세포질에 존재하는 수분 (H , O) 을 제거하는과정으로순차적인 고농도알코올용액에 샘플을담구어 수분율탈수시키고 알코올로대체시킨다.
® 투명화 (clearing)
탈수과정의 알코올은 지용성 파라핀과 혼합되지 않으므로 파라핀에 혼합될 수 있는 물질인 자일렌 (xylene) 또는 톨루엔 (toluene) 치환시킨다. 이과정에서세포의굴절률과유사해져세포가투영하게나타난다.
® 파라핀 포매 (embedding)
자일렌 등으로 투명화된 샘플을 열에 의해 용해된 파라띤 용액에 첨가하여 자일렌을 파라핀으로 교체시킨 후 냉각시켜 샘플을 굳게 만든다.
® 박편자르기
파라핀으로 포매 (embedding) 된 샘플조직을 마세칼날 (microtome) 로 이용하여 향후 염색과 현미경 관찰에 용이한 두께의 박편으로 자른다.
Step 2. 가수 (hydration)
® 파라핀 제거 (deparaffin) 와 가수
전하성 염색약은 파라핀에 용해되지 않기 때문에 박펀울 위해 첩가되었던 지용성 파라핀을 다시 수분 (H , O)으로 대체해야한댜 따라서 탈수와 반대로 xylene · (100% EtOH ···• 95% ···•85% ···•70% EtOH) ···• H,O 로 순차적으로 처리하여 조직 내 존재하는 paraffin을 재거하고 수분 (H , O) 으로 대체시칸다.
Step 3. Hematoxylin염색
® CD Hematoxylin 처리
Hematoxylin + aluminum (따 염기성 매염재) 염색약을 닷본 동안 처리한다.
® 염색
1% HCI-EtOH(pH2-3) 를 5-10방울 떨어뜨리면 hematoxylin 의 알코올 (-OH) 의 음전하가 감소하고 매염재 (Al + ) 의 양전하에 의해 음전하성 물질에 이온결합한다.
® 발색
0.5% 암모니아수를 5-10방울 떨어뜨리면 pH 가중화되면서 hematoxylin 이 청색으로 발색한다.
Step 4. Eosin염색
® Eosin 염색
산성 esoin을 약알칼리 상태 (주; eosin 의 음전하 부여)에서 처 리하여 세포내 양전하성 물질 (예;세포질 단백질)에 이온결합시킨다.
Step 5. 탈수 (dehyration ) 및 mounting
® 탈수 (dehydration) 및 투명화 (clearing)
염색울 위해 세포에 치환시켰던 수분을 제거하고 세포외 바탕질 (ECM) 의 굴절률과 유사한 xylene으로 치환시켜 세포관찰을 용이하게 과정이 필요하다 [H20 ···• (70% ···• 85% ···• 95% ···• 100%) EtOH ···• xylene]
® Mounting
염색된 샘플의 산화 및 부패를 방지하기 위해 항산화제를 포함한 투명 합성수지액으로 코팅 후 건조시켜 샘플에 산소와 마생물의 접촉울 방지한다. Mounting 된 샘풀은 현미경을 통해 관찰하거나 장기보관이 가능하다.
겔여과 크로마토그래피 (gel filtration chromatography)
겔여과 크로마토크래피는 전기 영동과 유사하게 혼합된 물질을 분자량에 따라 분리하는 방법이댜 다공성 충진제 (주; porous resin) 로 채워진 유리관(column) 에 입체구조의 단백질 혼합물을 흘려보내면 저분자 물질은 다공성 충진제의 미세구멍을 통과하면서 느리게 분리되지만, 고분자 물질은 충진제 사이를 통과하면서 신속하게 분리된다. 따라서 초기 분획에는 고분자성 물질이 분리되고 후기 분획일수록 저분자성 물질이분리된다.
염침전과단백질분리
전가영동의 겔과 달리 겔여과 크로마토그레피의 경우 작은구멍이 뚫린 다공성 충진재를 사용하므로 저분자물질이 느리게 분리된다. 또한 겔여과 크로마토그래피는 입체구조 단백질(四 다량체)을 분리하지만 SDS-PAGE는 계면활성제와 환원제를 처리하기 때문에 단량체로만 분리된다.
친화 크로마토그래피 (affinity chromatography)
표적물질과 특이적인 친화도를 갖는 충진제(항체)로 채워진 컬럼에 혼합물을 흘려보내 항체에 특이적인 물질만 선택적으로 분리시키는 방법으로 순수분리의 효율성이 높지만 경제적으로 고가의 방법이다. 항체에 결합된 표적물질은 용출용액 (pH 의 변화)를 주어 항체와 항원의 결합(비공유결합)을 방해하여 순수하게 분리시킬 수 있다. 친화크로마토그래피에서는 항체뿐 만 아니라 상호친화력을 갖는 다양한 물질을 이용할 수 있다.
전기영동 (electrophoresis)
전기영동은 다양한 분자량의 DNA 또는 단백질 혼합물을 분자량에 따라 분리시키는 방법이다. 전기영동에서는 DNA 또는 단백질을 전극(양극)방향으로 끌면서 겔(gel)을 투과할 때 분자량에 따라 이동 속도의 차이에 의해 분리시킨다.